Proteini APOBEC in onkogeneza virusov HPV
Predstavitev problema
Humani virusi papiloma (HPV) spadajo med najpogostejše spolno prenosljive patogene, ki so odgovorni za več kot 5 % vseh rakov pri ljudeh, vključno z večino raka materničnega vratu in delom raka glave in vratu. Proteini APOBEC3 (A3) so cistidinske deaminaze, ki so spreminjajo nukleotidno sestavo molekul DNA in RNA. Ta proces je eden izmed ključnih obrambnih mehanizmov pri virusnih infekcijah, vendar je odgovoren tudi za pojav mutacij v gostiteljski celici in razvoj rakavih bolezni. Nedavne raziskave so pokazale, da so proteini APOBEC glavni vir somatskih mutacij pri raku materničnega vratu, molekularni mehanizmi teh procesov pa so še vedno slabo pojasnjeni.
Osrednji cilj raziskave je razumeti vlogo proteinov APOBEC pri onkogenezi virusov HPV. Te procese smo proučevali z različnih zornih kotov, ki so vključevali biostatistične analize, genomske študije ter eksperimentalne metode molekularne ter celične biologije.
Rezultati projekta
Specifični cilj:
Cilj 1: Določiti genetske in epigenetske spremembe, ki so vezane na izražanje proteinov APOBEC, v tumorskih vzorcih raka materničnega vratu in modelnih sistemih HPV.
V prvem delu projekta (WP1)smo analizirali ekspresijske profile pacientov z rakom materničnega vratu (CESC) in raka glave in vratu (HNSCC), pri čemer smo uporabili javno dostopne podatke TCGA (The Cancer Genome Atlas). Rezultat tega dela je podatkovna baza genov, katerih ekspresija je spremenjena glede na izražanje proteinov APOBEC3A (A3A) in APOBEC3B (A3B) v CESC in HNSCC. V bazo podatkov so vključeni vsi geni, katerih korelacija glede na izražanje A3A ali A3B je večja od 0,3. Za vsak vključeni gen so pri HNSCC dodani tudi podatki o izražanju pri HPV pozitivnih pacientih v primerjavi z HPV negativnimi pacienti, razlika v metilacijskem statusu posameznega gena pri HPV pozitivnih pacientih v primerjavi z HPV negativnimi pacienti. V drugem delu so podatkovni bazi dodani prosto dostopni ekspresijski podatki iz izbranih objavljenih študij. Podatkovna baza omogoča iskanje po ključnih besedah (ime gena) in po stopnji korelacije z A3A in A3B oziroma izražanja v HPV-pozitivnih tkivih.
Analiza podatkovne zbirke je vodila do zanimivih ugotovitev o razlikah med CESC in HNSCC. Pokazali smo, da ekspresija A3A in A3B pri CESC pozitivno korelira s podobnim naborom genom. Pri HNSCC pa posamezni geni korelirajo z ekspresijo A3A ali A3B, pri čemer gre večinoma za negativno korelacijo. Geni s pozitivno korelacijo glede na ekspresijo A3B imajo višjo ekspresijo v HPV-pozitivnih pacientih, medtem ko so geni, ki korelirajo z ekspresijo A3A, bolje zastopani pri HPV-negativnih HNSCC pacientih.
V drugem delu tega sklopa projekta (WP3) smo analizirali transformacijski potencial HPV gostiteljskih celice HFK in HFK-16 v povezavi z izražanjem proteinov A3A in A3B. Ugotovili smo, da utišanje gena A3A in A3B zmanjša stopnjo metabolizma, adhezivnost, migracijo ter invazivnost, pri čemer ima prisotnost genoma HPV16 (onkogenov HPV E6 in E7) le manjši vpliv. Analizirali smo tudi izražanje onkoproteinov HPV E6 in E7 na transkripcijski in proteinski ravni in ugotovili, da njuno izražanje ni povezano z izražanjem proteinov A3A ali A3B.
Cilj 2: Ugotoviti časovni okvir in mehanizme transformacije s HPV okuženih celic, kot posledica delovanja proteinov APOBEC3.
Da bi dobili vpogled v časovni potek somatskih sprememb, ki nastanejo v HPV okuženih celicah zaradi delovanja proteinov A3, smo celice HFK transficirali z genomom HPV 16, ki se v začetnih fazah nahaja v episomalni obliki (WP2). Med dolgotrajno kulturo celice z episomalnim genomom HPV 16 spontano preidejo v populacijo celic, ki vsebuje večinoma integriran genom HPV 16. Celice HFK so bile uspešno transficirane z genomom HPV, prav tako je prišlo do integracije virusne DNA v genom gostiteljskih celic po približno 14 mesecih gojenja celic. Ta del projekta je potekal v sodelovanju s skupino dr. Vjekoslava Tomaića z Instituta Rudjer Bošković v Zagrebu. Analiza transkriptoma, metiloma in editoma nam bo povedala, katere genetske in epigenetske spremembe se zgodijo v procesu integracije virusne DNA v genom gostiteljskih celic in njihov približen časovni okvir.
V zadnjem delu projekta (WP4) smo podatke iz WP1 uporabili za selekcijo izbranih onkogenov za nadaljnjo analizo. Vključitveni kriteriji so bili visoka stopnja korelacije z A3A in/ali A3B, diferencialno izražanje v HPV-pozitivnih tkivih in ustrezen metilacijski status. S presejalnimi testi smo identificirali najobetavnejše proteine, ki jih bomo biokemijsko karakterizirali v modelnih sistemih različnih HPV gostiteljskih celic in v povezavi s A3A in A3B.
Zaključek:
Rezultati raziskave so jasno pokazali, da proteina APOBEC3A in 3B vplivata na izražanje številnih drugih proteinov v tkivih, ki so inficirana z virusi HPV. Velik vpliv pa imata tudi na celične lastnosti, ki so pomembne pri transformaciji celic, kot so proliferacija, migracija in invazivnost. Nova spoznanja prispevajo k razkrivanju mehanizmov onkogeneze virusov HPV, kar lahko posredno prispeva k razvoju kliničnih in aplikativnih raziskav virusov HPV in drugih virusnih infekcij. Še zlasti to velja za druge majhne onkogene viruse DNA, ki so prav tako potencialna tarča delovanja proteinov APOBEC. Vsekakor je to področje, ki ga je potrebno čimprej raziskati, saj bomo le tako lahko izkoristili to znanje za preprečevanje in zdravljenje bolezni, ki nastanejo kot posledica okužbe s HPV in drugih virusov, kjer so vpleteni proteini APOBEC. Nenazadnje, projekt se je osredotočal na proučevanje interakcij med patogenom in gostiteljem. Rezultati te raziskave so pripomogli z razumevanju mehanizmov, ki usmerjajo ko-evolucijo virusov in njihovih gostiteljskih celic, kar se v zadnjem času poglobljeno raziskuje.
Partnerji na projektu: Laboratorij za vede o okolju in življenju Univerze v Novi Gorici (koordinator projekta), Fakulteta za farmacijo Univerze v Ljubljani, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani
Trajanje projekta: 1. 9. 2020 – 31. 8. 2023
Publikacije:
LOVŠIN, Nika, GANGUPAM, Bhavani, BERGANT MARUŠIČ, Martina. The intricate interplay between APOBEC3 proteins and DNA tumour viruses. Pathogens. 2024, vol. 13, no. 3, art. 187, 19 str., ilustr. ISSN 2076-0817. https://www.mdpi.com/2076-0817/13/3/187, DOI: 10.3390/pathogens13030187. [COBISS.SI-ID 186197507]
SRPČIČ, Anja, LOVŠIN, Nika. Sistem CRISPR/Cas9 in njegova uporaba v genetskem inženirstvu. Farmacevtski vestnik. [Tiskana izd.]. 2023, 74(3), 205-214, https://www.sfd.si/wp-content/uploads/2023/07/srpcic-fv3.pdf [COBISS.SI-ID 160756739]
CARSE, Sinead, BERGANT MARUŠIČ, Martina, SCHÄFER, Georgia. Advances in targeting HPV infection as potential alternative prophylactic means. International journal of molecular sciences. Feb. 2021, vol. 22, iss. 4, str. 1-26, ilustr. ISSN 1422-0067. https://www.mdpi.com/1422-0067/22/4/2201. [COBISS.SI-ID 53587971]
Vabljeno predavanje:
BERGANT MARUŠIČ, Martina, LAPENTA, Fabio, LOVŠIN, Nika. APOBEC proteins play an important role in human papillomavirus infection and oncogenesis. Biochemistry and molecular genetics in medicine: Scientific Symposium with International Participation, University of Ljubljana: 6.-7. 7. 2023, Ljubljana: Faculty of Medicine, 2023. Str. 45-46. https://www.mf.uni-lj.si/application/files/6516/8858/1409/Biochemistry_and_Molecular_Genetics_in_Medicine_proceedings.pdf [COBISS.SI-ID 159359747]
LOVŠIN, Nika. Approaches to function analyses (gene overexpression, gene knockout with CRISPR/Cas9 technology): vabljeno predavanje na Gemstone Training School 2022 “Osteoblast cell models and functional evaluation of GWAS hits” Ljubljana, 15.-17. 9. 2022. https://cost-gemstone.eu/wp-content/uploads/Gemstone-workshop-2022-Final-program-.pdf. [COBISS.SI-ID 150760707]
BERGANT MARUŠIČ, Martina. Human papillomaviruses interfere with host cell processes during infection: lecture at ICGEB, Cape Town, South Africa, 5. 7. 2022, on-line. https://www.icgeb.org/martina-bergant-marusic/ [COBISS.SI-ID 114229251]
Predstavitev na znanstveni konferenci:
LOVŠIN, Nika, LAPENTA, Fabio, PEČAR FONOVIĆ, Urša, JAZBEC, Katerina, MALIČEV, Elvira, BERGANT MARUŠIČ, Martina. Contribution of APOBEC proteins 3A and 3B to the oncogenicity of HPV viruses. 15th Meeting of the Slovenian Biochemical Society with International Participation: book of abstracts: Portorož, 20-23 September 2023. Ljubljana: Slovensko biokemijsko društvo, 2023. Str. 119, p68. [COBISS.SI-ID 165634307]
LAPENTA, Fabio, PAPAROKIDOU, Christina, BERGANT MARUŠIČ, Martina. Correlation of APOBEC3A and APOBEC3B gene expression in HNSCC TCGA study. V: NADIŽAR, Nejc (ur.). 17th CFGBC Symposium: book of abstracts, 6th june 2022. Ljubljana: Faculty of Medicine, 2022. Str. 36. [COBISS.SI-ID 131562499]
